Che cos'è la spettroscopia di fluorescenza?
La spettroscopia di fluorescenza analizza la fluorescenza delle molecole in base alle loro proprietà fluorescenti.
La fluorescenza è la luminescenza che si verifica quando una molecola viene eccitata da un fotone in uno stato eccitato elettronicamente per tornare allo stato fondamentale.
La spettroscopia di fluorescenza utilizza un raggio di luce per eccitare gli elettroni in alcune molecole composte e farle emettere luce. La luce passa attraverso un monocromatore ed entra in un rivelatore dove viene rilevata, che viene utilizzato per misurare e identificare molecole o cambiamenti nelle molecole.
Introduzione alla fluorescenza costante-Spettroscopia di stato e test a vita
La fluorescenza si riferisce in generale al fenomeno della luminescenza, la luce emessa dalle molecole. Ci sono diversi tipi di bagliore.
La fotoluminescenza è l'emissione di fotoni eccitati dall'energia luminosa o dai fotoni.
La chemiluminescenza, definita come la luminescenza dei fotoni eccitati dall'energia chimica, include la bioluminescenza, come si vede nelle lucciole e in molte forme di vita marina.
L'elettroluminescenza è l'emissione di fotoni quando l'energia elettrica o un forte campo elettrico stimola i fotoni, come in alcune applicazioni di illuminazione.
In particolare, la fluorescenza è un tipo di fotoluminescenza in cui la luce mette gli elettroni in uno stato eccitato. Lo stato eccitato perde rapidamente energia termica nell'ambiente attraverso la vibrazione, quindi emette fotoni dallo stato eccitato di singoletto più basso. Questo processo di emissione di fotoni compete con altri processi non radiativi, inclusi il trasferimento di energia e la perdita di calore.
Quando viene utilizzato il termine "fluorescenza", lo stesso metodo di misurazione si applica generalmente a qualsiasi delle classi di luminescenza di cui sopra.
Che cos'è la spettroscopia di fluorescenza?
Eccitazione di fluorescenza e spettri di emissione che si rispecchiano a vicenda. La spettroscopia di fluorescenza utilizza l'emissione e l'eccitazione per vedere come sta cambiando un campione.
Fig. 1: Uno spettro di eccitazione di fluorescenza (blu) e uno spettro di emissione (viola) sono immagini speculari l'uno dell'altro
La spettroscopia di fluorescenza in stato stazionario-si verifica quando una molecola emette fluorescenza quando viene eccitata da una sorgente di luce costante e i fotoni o l'intensità emessi vengono rilevati in funzione della lunghezza d'onda. Lo spettro di emissione di fluorescenza è quando la lunghezza d'onda di eccitazione è fissa, la lunghezza d'onda di emissione viene scansionata e si ottiene la relazione tra l'intensità e la lunghezza d'onda di emissione.
Lo spettro di eccitazione della fluorescenza è quando la lunghezza d'onda di emissione è fissa, modificando la lunghezza d'onda del monocromatore di eccitazione, scansionando l'intensità a diverse lunghezze d'onda. In questo modo, lo spettro fornisce informazioni sul campione e sulle lunghezze d'onda di assorbimento per selezionare la lunghezza d'onda di emissione singola ottimale per il rilevamento dell'emissione. È simile alla spettroscopia di assorbimento, ma è una tecnica più sensibile in termini di limiti di rivelazione e specificità molecolare. Gli spettri di eccitazione sono specifici per una singola lunghezza d'onda/specie di emissione, rispetto agli spettri di assorbimento di tutte le specie assorbenti nella soluzione di misurazione o nel campione. Gli spettri di emissione ed eccitazione di un dato fluoroforo sono immagini speculari l'uno dell'altro. Tipicamente, gli spettri di emissione appaiono a lunghezze d'onda più elevate (energie inferiori) rispetto agli spettri di eccitazione o assorbimento
Questi due tipi spettrali (emissione ed eccitazione) vengono utilizzati per osservare come cambia il campione. L'intensità spettrale e la lunghezza d'onda del picco possono variare con variabili come temperatura, concentrazione o interazioni con le molecole circostanti. Ciò include l'estinzione di molecole e molecole o materiali coinvolti nel trasferimento di energia. Alcuni fluorofori sono sensibili alle proprietà dell'ambiente del solvente, come pH, polarità e determinate concentrazioni ioniche.
Quali tipi di molecole o materiali mostrano fluorescenza?
Spettri di emissione di fluorescenza di alcuni fluorofori comuni. I fluorofori svolgono il ruolo centrale nella spettroscopia di fluorescenza e rendono questo tipo di spettroscopia una tecnica altamente sensibile.
Fig. 2: Spettri di emissione di fluorescenza di alcuni fluorofori comuni attraverso lo spettro UV e visibile
Molecole e materiali fluorescenti sono disponibili in tutte le forme e dimensioni. Alcuni sono intrinsecamente fluorescenti, come la clorofilla ei residui di amminoacidi triptofano (Trp), fenilalanina (Phe) e tirosina (Tyr). Altre sono molecole sintetizzate come coloranti organici stabili o tag che possono essere aggiunti ad altri sistemi non{0}}fluorescenti. In generale, le molecole organiche fluorescenti hanno caratteristiche strutturali come anelli aromatici ed elettroni π-coniugati. A seconda delle loro dimensioni e struttura, i coloranti organici emettono luce in lunghezze d'onda che vanno dall'ultravioletto al vicino-infrarosso.
Di seguito sono riportati alcuni fluorofori comuni casuali la cui emissione può essere vista nell'intervallo UV{0}}Vis. Per alcuni elementi di terre rare, come i lantanidi, a causa del riempimento degli orbitali elettronici più alti, le transizioni elettroniche dovute al trasferimento di carica dai ligandi metallici si verificano tra gli orbitali 4f-5d o addirittura 4f-4f. (Bunzli, 1989) Ci sono molte molecole che emettono luce in natura, come alcuni aminoacidi, clorofilla e pigmenti naturali. Altri ancora sono progettati con cura per usi speciali nella spettroscopia di fluorescenza
Esempi di molecole e materiali fluorescenti:
Aminoacidi (Trp, Phe, Tyr)
Derivati della coppia di basi (2-AP, 3-MI, 6-MI, 6-MAP, pirrolo-c, tC)
clorofilla
Proteine fluorescenti (FP)
Coloranti organici (fluoresceina, rodamina, n-aminocumarine e loro derivati)
Elementi di terre rare (lanthanides)
semiconduttore
punti quantici
nanotubi di carbonio a parete singola-
Batteria solare
Pigmento, galvanica
fosforo
Di più…
Altre molecole e materiali come proteine fluorescenti, semiconduttori, fosfori ed elementi di terre rare sono campioni fluorescenti comunemente usati. I polimeri contenenti idrocarburi o dieni aromatici coniugati spesso hanno anche proprietà fluorescenti. Naturalmente, gli scienziati hanno anche lavorato alla creazione di nuovi materiali.
